Veicot ģenētiskos pētījumus, mēs bieži sastopamies ar nepietiekamiem RNS paraugiem, piemēram, lai pētītu sīkus anatomiskus mutes audzējus, pat vienas šūnas paraugus un specifisku gēnu mutāciju paraugus, kas cilvēka šūnās tiek transkribēti ļoti zemā līmenī.Protams, COVID-19 testa veikšanai, ja uztriepes nebūs īstajā vietā vai paraugu ņemšanas laikā nebūs pietiekami daudz reižu, izlases lielums būs ļoti mazs, tāpēc Veselības un ģimenes plānošanas komisija nāca klajā pirms divām dienām un izturēja testu, un, ja nukleīnskābes paraugu ņēmējs nepaņēma sešus paraugus, varat par to ziņot.
Reaģenta jutība ir svarīga, jo mums ir šī vai cita problēma. Ko mēs varam darīt, lai uzlabotu RT-PCR jutīgumu?
Pirms apspriežam iespējamos risinājumus, pieminēsim divus lielus sarežģījumus ar tikko pieminēto situāciju.
Pirmkārt, mēs uztraucamies par RNS zudumu, ja mūsu paraugā ir tikai dažas šūnu populācijas.Ja tiek izmantotas tradicionālās atdalīšanas un tīrīšanas metodes, piemēram, kolonnas metode vai nukleīnskābju izgulsnēšanas metode, pastāv liela iespēja, ka daži paraugi tiks zaudēti.Viens risinājums ir pievienot nesējmolekulu, piemēram, tRNS, taču pat tad nav garantijas, ka mūsu atkopšanas eksperiments ir kārtībā.
Tātad, kāds ir labāks veids?Laba iespēja kultivētām šūnām vai mikroanatomiskiem paraugiem ir tiešās līzes izmantošana.
Ideja ir sadalīt šūnas uz 5 minūtēm, atbrīvot RNS šķīdumā, pēc tam apturēt reakciju uz 2 minūtēm, pēc tam pievienot lizātu tieši reversās transkripcijas reakcijai, lai RNS nezustu, un visbeidzot tieši ievietot iegūto cDNS. reāllaika reakcijā.
Bet ko darīt, ja ierobežota sākuma punkta vai neliela mērķa gēna ekspresijas dēļ mēs varam pārstrādāt visu RNS un joprojām nenodrošināsim pietiekami daudz veidņu, lai iegūtu labu reāllaika signālu?
Šajā gadījumā priekšpastiprināšanas darbība var būt ļoti noderīga.
Tālāk ir sniegta shēma, lai palielinātu jutību pēc reversās transkripcijas.Pirms darba sākšanas mums ir jājautā, kuri mērķi mūs interesē, lai izstrādātu īpašus primerus šiem mērķiem iepriekšējai pastiprināšanai.
To var panākt, izveidojot jauktu gruntskrāsu ar līdz pat 100 gruntskrāsu pāriem un reakcijas ciklu no 10 līdz 14 reizēm.Tāpēc, lai iepriekš pastiprinātu iegūto cDNS, ir nepieciešams Master Mix, kas īpaši izstrādāts šai prasībai.
Iemesls ciklu skaita iestatīšanai no 10 līdz 14 ir tāds, ka šis ierobežotais ciklu skaits nodrošina nejaušību starp dažādiem mērķiem, kas ir ļoti svarīgi pētniekiem, kuriem nepieciešama kvantitatīvā molekulārā informācija.
Pēc iepriekšējas pastiprināšanas mēs varam iegūt lielu daudzumu cDNS, tādējādi ievērojami uzlabojot noteikšanas jutību aizmugurē, un mēs pat varam atšķaidīt paraugu un veikt vairākas reāllaika PCR reakcijas, lai novērstu iespējamās nejaušās kļūdas.
Publicēšanas laiks: 11.04.2023